間充質細胞中的 NAD 補償途徑(Salvage Pathway)對於小鼠骨骼發育是不可或缺的 (2023/06)
摘要
NAD 是細胞能量代謝和多種其他過程的重要輔助因子。 系統性 NAD+ 缺乏與人類和小鼠發育過程中的骨骼畸形有關。 NAD 水平由多種合成途徑維持,但哪些途徑在骨形成細胞中很重要尚不清楚。 在這裡,我們培育了四肢所有間充質譜系細胞中煙酰胺磷酸核糖基轉移酶 (Nampt) 缺失的小鼠,Nampt 是 NAD 挽救途徑中的關鍵酶。 出生時,NamptΔPrx1 由於生長板軟骨細胞死亡而表現出急劇的肢體縮短。 懷孕期間服用 NAD 前體煙酰胺核苷可預防大多數子宮內缺陷。 出生後 NAD 的消耗也會促進軟骨細胞死亡,防止進一步的軟骨內骨化和關節發育。 相反,在基因敲除小鼠中,成骨細胞的形成仍然發生,這與明顯不同的微環境以及對軟骨細胞和成骨細胞之間氧化還原反應的依賴相一致。 這些發現明確了軟骨內骨形成過程中細胞自主 NAD 穩態的關鍵作用。
簡介
簡介
煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是細胞能量代謝和許多細胞過程的關鍵輔助因子,例如細胞分裂,DNA損傷修復和線粒體功能。 在其氧化狀態下,NAD+及其磷酸化版本NADP+能夠接受兩個電子,從而使該分子對氧化還原穩態必不可少。 在這一角色中,NAD+對於糖酵解,TCA循環,β-氧化和谷氨酰胺溶解的碳源的分解代謝至關重要。 相反,氧化還原對NADP+/NADPH主要用於合成代謝過程,例如脂質和膽固醇合成。 NAD+還充當許多酶的降解底物,例如Sirtuins,PARPS和環狀ADP-核糖合成酶,例如CD38和CD157。
NAD是由多種途徑等飲食前體(例如色氨酸和維生素B3(NIACIN))合成的。 維生素B3是菸酸(NA),煙酰胺(NAM)和煙酰胺核糖苷(NR)的集體術語。 Kynurenine Pathway,也稱為DeNe軍,從色氨酸產生NAD。 預科手和打撈途徑分別從Na和NAM產生NAD。 導致NAD+生產的不同途徑的存在引發了有關每種途徑到各種組織的相對重要性的問題。 例如,NAD合成的Kynurenine途徑似乎主要發生在肝臟中,因為該途徑的幾種酶在大多數其他組織中未表達。 此外,大多數NAD+前體的等離子水平較低,並且很可能無法系統地維持NAD+生產率高。 NAD+的細胞內水平由細胞氧化還原態(即NAD+/NADH)和NAD+生物合成和降解之間的平衡確定。 NAD依賴性的Sirtuins,PARP和環狀ADP-核糖合成酶將NAD+代謝為NAM。 這些過程中產生的NAM可以通過補充途徑(salvage pathway)回收到NAD。
使用遺傳學和藥理學工具的多項研究已經闡明了NAD的減少在包括骨質疏鬆症在內的幾種衰老疾病中具有致病作用。 此外,發育過程中發生的骨骼畸形與NAD缺乏症有關。 大多數哺乳動物骨骼,包括四肢長的長骨,通過稱為內側軟骨骨化的過程形成。 在胚胎發育過程中,間充質細胞從側板中胚層下降,並在肢體芽內形成冷凝。 這些細胞分化為形成和擴展的軟骨細胞,並擴展一種稱為軟骨anlage的血管結構。 最初,軟骨細胞以高速率增殖,並產生富含II型膠原蛋白和蛋白聚醣的細胞外基質。 接下來,它們退出細胞週期並分化為產生X型膠原蛋白的肥厚細胞。 血管侵襲肥厚區域允許形成一個稱為主要骨化中心的骨髓腔,並用骨骼替換軟骨。 由於包含生長板的軟骨細胞的增殖和肥大,軟骨模板繼續從兩個骨頭(epiphyses)延伸。 實際上,這些結構包含三個不同的靜息,增殖和肥厚的軟骨細胞。 出生後,肥厚的軟骨細胞區域隨後在骨physise分析的中心發展,然後是血管侵襲和骨基質的沉積,啟動了次級骨化中心的形成。 或者,某些骨骼(例如頭骨的平坦骨骼)通過間充質骨內骨化而形成,在該過程中,間充質細胞直接分化為成骨細胞。
軟骨發育的正常序列的破壞會導致人類的多種骨骼發育不良。 kynurenine途徑酶的雙重功能喪失變體導致包括骨骼在內的幾個器官的先天性畸形,因此NAD缺乏症,導致NAD缺乏症。 這些畸形表型已被歸類為先天性NAD缺乏症,也稱為椎骨,心臟,腎臟和肢體缺陷綜合徵(分別在線孟德爾遺傳[OMIM]數字617660和617661)。 同樣,在妊娠期間,NAD前體的限制性母體攝入量導致心臟,腎臟和骨架等器官的畸形。 儘管如此,這些作用的全身性質排除了關於NAD在骨細胞中直接影響的任何結論。 為了闡明特異性骨細胞種群中NAD對骨骼發育的貢獻,我們在間充質譜系細胞中以有條件缺失NAMPT的條件缺失(一種NAD補償途徑中的必需酶)產生了小鼠。 我們發現,骨軟骨生殖器中的NAD補充途徑對於胚胎骨骼發育以及產後骨骼生長和穩態是必不可少的。
結果
NAD是由多種途徑等飲食前體(例如色氨酸和維生素B3(NIACIN))合成的。 維生素B3是菸酸(NA),煙酰胺(NAM)和煙酰胺核糖苷(NR)的集體術語。 Kynurenine Pathway,也稱為DeNe軍,從色氨酸產生NAD。 預科手和打撈途徑分別從Na和NAM產生NAD。 導致NAD+生產的不同途徑的存在引發了有關每種途徑到各種組織的相對重要性的問題。 例如,NAD合成的Kynurenine途徑似乎主要發生在肝臟中,因為該途徑的幾種酶在大多數其他組織中未表達。 此外,大多數NAD+前體的等離子水平較低,並且很可能無法系統地維持NAD+生產率高。 NAD+的細胞內水平由細胞氧化還原態(即NAD+/NADH)和NAD+生物合成和降解之間的平衡確定。 NAD依賴性的Sirtuins,PARP和環狀ADP-核糖合成酶將NAD+代謝為NAM。 這些過程中產生的NAM可以通過補充途徑(salvage pathway)回收到NAD。
使用遺傳學和藥理學工具的多項研究已經闡明了NAD的減少在包括骨質疏鬆症在內的幾種衰老疾病中具有致病作用。 此外,發育過程中發生的骨骼畸形與NAD缺乏症有關。 大多數哺乳動物骨骼,包括四肢長的長骨,通過稱為內側軟骨骨化的過程形成。 在胚胎發育過程中,間充質細胞從側板中胚層下降,並在肢體芽內形成冷凝。 這些細胞分化為形成和擴展的軟骨細胞,並擴展一種稱為軟骨anlage的血管結構。 最初,軟骨細胞以高速率增殖,並產生富含II型膠原蛋白和蛋白聚醣的細胞外基質。 接下來,它們退出細胞週期並分化為產生X型膠原蛋白的肥厚細胞。 血管侵襲肥厚區域允許形成一個稱為主要骨化中心的骨髓腔,並用骨骼替換軟骨。 由於包含生長板的軟骨細胞的增殖和肥大,軟骨模板繼續從兩個骨頭(epiphyses)延伸。 實際上,這些結構包含三個不同的靜息,增殖和肥厚的軟骨細胞。 出生後,肥厚的軟骨細胞區域隨後在骨physise分析的中心發展,然後是血管侵襲和骨基質的沉積,啟動了次級骨化中心的形成。 或者,某些骨骼(例如頭骨的平坦骨骼)通過間充質骨內骨化而形成,在該過程中,間充質細胞直接分化為成骨細胞。
軟骨發育的正常序列的破壞會導致人類的多種骨骼發育不良。 kynurenine途徑酶的雙重功能喪失變體導致包括骨骼在內的幾個器官的先天性畸形,因此NAD缺乏症,導致NAD缺乏症。 這些畸形表型已被歸類為先天性NAD缺乏症,也稱為椎骨,心臟,腎臟和肢體缺陷綜合徵(分別在線孟德爾遺傳[OMIM]數字617660和617661)。 同樣,在妊娠期間,NAD前體的限制性母體攝入量導致心臟,腎臟和骨架等器官的畸形。 儘管如此,這些作用的全身性質排除了關於NAD在骨細胞中直接影響的任何結論。 為了闡明特異性骨細胞種群中NAD對骨骼發育的貢獻,我們在間充質譜系細胞中以有條件缺失NAMPT的條件缺失(一種NAD補償途徑中的必需酶)產生了小鼠。 我們發現,骨軟骨生殖器中的NAD補充途徑對於胚胎骨骼發育以及產後骨骼生長和穩態是必不可少的。
結果
間充質細胞中 Nampt 的缺失會損害骨骼發育
為了檢查 NAD 補充途徑在骨骼發育中的作用,我們使用 Prx1-Cre 轉基因小鼠刪除肢體所有間充質細胞中的 Nampt,包括軟骨細胞和成骨細胞的前體細胞 (NamptΔPrx1)。 Prx1-Cre 還針對顱骨和胸骨的前體,但不影響中軸骨骼。 Cre 重組酶活性在發育早期就開始,前肢比後肢更強。 NamptΔPrx1 小鼠以預期的孟德爾比率出生,但在出生時表現出四肢嚴重縮短(圖 1a)。 所有小鼠均在出生後幾天內死亡,原因尚不清楚。 P3 時的整體骨骼染色證實,與對照組相比,NamptΔPrx1 胚胎中的所有肢體骨骼元件均明顯較短(圖 1b)。 前肢受到更嚴重的影響,顯示出非常初級的莖足(肱骨)和尺足(橈骨和尺骨),並且缺少自足(爪子),很可能是由於該部位的 Prx1-Cre 外顯率較高(圖 1b)。 同樣,在後肢中,不存在自足形成(圖1c)。 免疫染色證實P2 NamptΔPrx1後肢的生長板軟骨細胞內Nampt表達缺失,與Prx1-Cre未靶向的周圍肌肉細胞相反(圖1d)。 與四肢類似,Nampt 缺失導致胸骨縮短(圖 1e)。 相比之下,顱面骨骼未見明顯缺陷(圖1f)。
為了檢查 NAD 補充途徑在骨骼發育中的作用,我們使用 Prx1-Cre 轉基因小鼠刪除肢體所有間充質細胞中的 Nampt,包括軟骨細胞和成骨細胞的前體細胞 (NamptΔPrx1)。 Prx1-Cre 還針對顱骨和胸骨的前體,但不影響中軸骨骼。 Cre 重組酶活性在發育早期就開始,前肢比後肢更強。 NamptΔPrx1 小鼠以預期的孟德爾比率出生,但在出生時表現出四肢嚴重縮短(圖 1a)。 所有小鼠均在出生後幾天內死亡,原因尚不清楚。 P3 時的整體骨骼染色證實,與對照組相比,NamptΔPrx1 胚胎中的所有肢體骨骼元件均明顯較短(圖 1b)。 前肢受到更嚴重的影響,顯示出非常初級的莖足(肱骨)和尺足(橈骨和尺骨),並且缺少自足(爪子),很可能是由於該部位的 Prx1-Cre 外顯率較高(圖 1b)。 同樣,在後肢中,不存在自足形成(圖1c)。 免疫染色證實P2 NamptΔPrx1後肢的生長板軟骨細胞內Nampt表達缺失,與Prx1-Cre未靶向的周圍肌肉細胞相反(圖1d)。 與四肢類似,Nampt 缺失導致胸骨縮短(圖 1e)。 相比之下,顱面骨骼未見明顯缺陷(圖1f)。
圖一
間充質譜系細胞中的 Nampt 缺失嚴重損害骨骼發育。
P2 Namptf/+(對照)和 Namptf/f;Prx1-Cre (NamptΔPrx1) 小鼠。
新生兒骨骼的整體阿新藍-茜素紅 S 染色,以及(c) 後肢。
d 後肢生長板的連續石蠟切片顯示 H&E 或 Nampt 免疫染色(插圖 = = 同型對照)。 箭頭表示相鄰肌肉內的免疫陽性細胞(n = 3隻小鼠/組)。
e 胸腔的阿爾新藍-茜素紅 S 染色,以及 (f) 頭部。 獲得了四窩獨立的小鼠並顯示出相似的效果。
間充質譜系細胞中的 Nampt 缺失嚴重損害骨骼發育。
P2 Namptf/+(對照)和 Namptf/f;Prx1-Cre (NamptΔPrx1) 小鼠。
新生兒骨骼的整體阿新藍-茜素紅 S 染色,以及(c) 後肢。
d 後肢生長板的連續石蠟切片顯示 H&E 或 Nampt 免疫染色(插圖 = = 同型對照)。 箭頭表示相鄰肌肉內的免疫陽性細胞(n = 3隻小鼠/組)。
e 胸腔的阿爾新藍-茜素紅 S 染色,以及 (f) 頭部。 獲得了四窩獨立的小鼠並顯示出相似的效果。
Nampt 缺失會損害軟骨穩態
接下來,我們對四肢和胸骨進行了組織學檢查,以評估 NamptΔPrx1 小鼠骨骼中的細胞缺陷。 P2 時同窩對照小鼠股骨切片的 H&E 染色顯示了該年齡骨骺軟骨中存在的典型區域,即靜止區、增殖區和肥大區(圖 2a)。 NamptΔPrx1 小鼠的生長板表現出低軟骨細胞數量,幾乎完全不存在休息區。 存在增殖軟骨細胞的胰島以及肥大軟骨細胞。 Nampt 的缺失還導致細胞外基質的嚴重缺陷,如蛋白多醣的微弱的、主要是細胞周圍的番紅 O 染色所示,該蛋白多醣沒有與 II 型膠原蛋白的沉積緊密重疊。 在胸骨中觀察到非常相似的形態學發現(補充圖1)。 為了檢查細胞結構的減少是否是由於細胞死亡所致,我們進行了 TUNEL 染色。 在該年齡的對照小鼠的生長板上觀察到罕見的TUNEL陽性細胞(圖2b)。 相比之下,NamptΔPrx1 小鼠表現出大量陽性細胞。 組織學分析還表明,NamptΔPrx1 小鼠的滑膜關節形成受到破壞。 具體來說,股骨和脛骨之間以及脛骨和腓骨之間的關節被融合(圖2c)。
接下來,我們對四肢和胸骨進行了組織學檢查,以評估 NamptΔPrx1 小鼠骨骼中的細胞缺陷。 P2 時同窩對照小鼠股骨切片的 H&E 染色顯示了該年齡骨骺軟骨中存在的典型區域,即靜止區、增殖區和肥大區(圖 2a)。 NamptΔPrx1 小鼠的生長板表現出低軟骨細胞數量,幾乎完全不存在休息區。 存在增殖軟骨細胞的胰島以及肥大軟骨細胞。 Nampt 的缺失還導致細胞外基質的嚴重缺陷,如蛋白多醣的微弱的、主要是細胞周圍的番紅 O 染色所示,該蛋白多醣沒有與 II 型膠原蛋白的沉積緊密重疊。 在胸骨中觀察到非常相似的形態學發現(補充圖1)。 為了檢查細胞結構的減少是否是由於細胞死亡所致,我們進行了 TUNEL 染色。 在該年齡的對照小鼠的生長板上觀察到罕見的TUNEL陽性細胞(圖2b)。 相比之下,NamptΔPrx1 小鼠表現出大量陽性細胞。 組織學分析還表明,NamptΔPrx1 小鼠的滑膜關節形成受到破壞。 具體來說,股骨和脛骨之間以及脛骨和腓骨之間的關節被融合(圖2c)。
Paragraph. NaNaNaNAatN圖二
Nampt缺失促進生長板軟骨細胞凋亡並破壞關節形成。
a P2 Namptf/+(對照)和 Namptf/f;Prx1-Cre (NamptΔPrx1) 股骨組織切片的 H&E、Safranin O/Fast Green 或 II 型膠原免疫染色(n = 3 隻小鼠/組)。
黑色虛線框被放大並顯示在右側。 RZ 休息區、PZ 增殖區、HZ 肥大區(n = 3 隻小鼠/組)。
b 股骨生長板中 TUNEL 測定的細胞死亡。 TUNEL 陽性信號呈綠色。
c 組織學切片如圖 a 所示,說明 NamptΔPrx1 小鼠後肢的融合關節。 獲得了四窩獨立的小鼠並顯示出相似的效果。
Nampt缺失促進生長板軟骨細胞凋亡並破壞關節形成。
a P2 Namptf/+(對照)和 Namptf/f;Prx1-Cre (NamptΔPrx1) 股骨組織切片的 H&E、Safranin O/Fast Green 或 II 型膠原免疫染色(n = 3 隻小鼠/組)。
黑色虛線框被放大並顯示在右側。 RZ 休息區、PZ 增殖區、HZ 肥大區(n = 3 隻小鼠/組)。
b 股骨生長板中 TUNEL 測定的細胞死亡。 TUNEL 陽性信號呈綠色。
c 組織學切片如圖 a 所示,說明 NamptΔPrx1 小鼠後肢的融合關節。 獲得了四窩獨立的小鼠並顯示出相似的效果。
給懷孕母親施用 NR 大大減輕了由 Nampt 缺失引起的骨骼發育缺陷
為了確認 NamptΔPrx1 小鼠中出現的缺陷是由於 NAD 減少所致,我們在懷孕期間給小鼠注射了 NAD 前體 NR。 NR 轉化為煙酰胺單核苷酸(NMN),後者通過補償途徑直接轉化為 NAD,繞過了 Nampt 的需要(圖 3a)。 約400mg/kg NR的劑量不足以改變NamptΔPrx1小鼠的發育缺陷(補充圖2)。 然而,如在 P2 時測定的那樣,向母鼠施用 1000mg/kg NR 大大減輕了 NamptΔPrx1 小鼠的骨骼缺陷。 具體來說,前肢形狀良好,包含莖足、宙足和自足等所有元素(圖 3b)。 下肢包含所有手指(圖 3c)。 免疫組織化學證實NamptΔPrx1小鼠後肢軟骨細胞中Nampt缺失(圖3d)。 正如預期的那樣,Nampt 表達在鄰近的肌肉組織中保持不受影響。 對照小鼠和 NamptΔPrx1 拯救小鼠的蛋白多醣番紅 O 染色高度相似(圖 3e)。 肱骨的 H&E 染色顯示,在妊娠期間接受 NR 的 NamptΔPrx1 小鼠的生長板與對照小鼠幾乎沒有區別(補充圖 3)。 此外,NR 給藥可預防關節畸形,如後肢和前肢所示(圖 3e 和補充圖 3)。 然而,NamptΔPrx1獲救小鼠的雙肢(圖3b,c)和胸骨(補充圖4)仍然比同窩對照小鼠短,並且半月板發育不良(圖3e)。 此外,NamptΔPrx1小鼠表現出一些TUNEL陽性細胞,特別是在膝蓋的生長板表面(圖3f)和其他滑膜關節(補充圖5)。 相反,如前所述,僅在對照 (Namptf/+) 四肢的軟骨膜/滑膜中觀察到 TUNEL 陽性21。 重要的是,給予母鼠的 NR 不會傳播到牛奶中22,因此,出生後,幼崽在哺乳時不會接受 NR 補充。 因此,NamptΔPrx1 拯救的小鼠在 P2 時出現死亡細胞是出生後 NAD 耗盡的早期結果。
為了確認 NamptΔPrx1 小鼠中出現的缺陷是由於 NAD 減少所致,我們在懷孕期間給小鼠注射了 NAD 前體 NR。 NR 轉化為煙酰胺單核苷酸(NMN),後者通過補償途徑直接轉化為 NAD,繞過了 Nampt 的需要(圖 3a)。 約400mg/kg NR的劑量不足以改變NamptΔPrx1小鼠的發育缺陷(補充圖2)。 然而,如在 P2 時測定的那樣,向母鼠施用 1000mg/kg NR 大大減輕了 NamptΔPrx1 小鼠的骨骼缺陷。 具體來說,前肢形狀良好,包含莖足、宙足和自足等所有元素(圖 3b)。 下肢包含所有手指(圖 3c)。 免疫組織化學證實NamptΔPrx1小鼠後肢軟骨細胞中Nampt缺失(圖3d)。 正如預期的那樣,Nampt 表達在鄰近的肌肉組織中保持不受影響。 對照小鼠和 NamptΔPrx1 拯救小鼠的蛋白多醣番紅 O 染色高度相似(圖 3e)。 肱骨的 H&E 染色顯示,在妊娠期間接受 NR 的 NamptΔPrx1 小鼠的生長板與對照小鼠幾乎沒有區別(補充圖 3)。 此外,NR 給藥可預防關節畸形,如後肢和前肢所示(圖 3e 和補充圖 3)。 然而,NamptΔPrx1獲救小鼠的雙肢(圖3b,c)和胸骨(補充圖4)仍然比同窩對照小鼠短,並且半月板發育不良(圖3e)。 此外,NamptΔPrx1小鼠表現出一些TUNEL陽性細胞,特別是在膝蓋的生長板表面(圖3f)和其他滑膜關節(補充圖5)。 相反,如前所述,僅在對照 (Namptf/+) 四肢的軟骨膜/滑膜中觀察到 TUNEL 陽性21。 重要的是,給予母鼠的 NR 不會傳播到牛奶中22,因此,出生後,幼崽在哺乳時不會接受 NR 補充。 因此,NamptΔPrx1 拯救的小鼠在 P2 時出現死亡細胞是出生後 NAD 耗盡的早期結果。
圖三
懷孕期間服用 NR 可挽救大部分由 Nampt 缺失引起的骨骼缺陷。
在懷孕期間,將NR添加到水壩的飲用水中。 NR 被轉化為 NMN 和 NAD,繞過了挽救途徑中對 Nampt 的需要。 使用 BioRender 創建的圖形。
b 前肢和 (c) 後肢的整體阿新藍-茜素紅 S 染色 (n = 3); 產前 NR (pNR)。
d、e P2 Namptf/+(對照)和 Namptf/f;Prx1-Cre (NamptΔPrx1) 膝蓋(代表每個基因型 2-3 隻幼崽)的連續切片,顯示 Nampt 免疫染色 (d)、番紅 O 蛋白聚醣染色 (e ),或死細胞的 TUNEL 染色(綠色熒光)
(f)。 股骨、脛骨、男性半月板。
懷孕期間服用 NR 可挽救大部分由 Nampt 缺失引起的骨骼缺陷。
在懷孕期間,將NR添加到水壩的飲用水中。 NR 被轉化為 NMN 和 NAD,繞過了挽救途徑中對 Nampt 的需要。 使用 BioRender 創建的圖形。
b 前肢和 (c) 後肢的整體阿新藍-茜素紅 S 染色 (n = 3); 產前 NR (pNR)。
d、e P2 Namptf/+(對照)和 Namptf/f;Prx1-Cre (NamptΔPrx1) 膝蓋(代表每個基因型 2-3 隻幼崽)的連續切片,顯示 Nampt 免疫染色 (d)、番紅 O 蛋白聚醣染色 (e ),或死細胞的 TUNEL 染色(綠色熒光)
(f)。 股骨、脛骨、男性半月板。
NAD補償途徑對於產後發育過程中骨骺骨形成是不可或缺的
NR 能夠挽救大部分產前發育缺陷,使小鼠能夠在出生後行走並存活。 這提供了在骨骺骨發育開始階段檢查生長闆對 Nampt 的依賴性的機會。 為此,在出生時去除 NR 的幼崽在 P7 和 P28 時進行了評估。 在 P7 時,對照小鼠的骨骺內存在二次肥大區,預示著二次骨化中心(圖 4a)。 NamptΔPrx1 小鼠中不存在這種肥大。 相反,在整個骨骺上看到了許多空的軟骨細胞陷窩。 TUNEL染色顯示軟骨細胞大量死亡(圖4b)。 此外,NamptΔPrx1 小鼠的關節軟骨和半月板出現細胞減少(圖 4c)。 此外,NamptΔPrx1小鼠軟骨中軟骨細胞特異性基因(例如Acan、Col2a1和Col10a1以及Mmp13和Runx2)的mRNA水平大大降低(圖4d)。 相反,Vegfa 的表達不受影響。
NR 能夠挽救大部分產前發育缺陷,使小鼠能夠在出生後行走並存活。 這提供了在骨骺骨發育開始階段檢查生長闆對 Nampt 的依賴性的機會。 為此,在出生時去除 NR 的幼崽在 P7 和 P28 時進行了評估。 在 P7 時,對照小鼠的骨骺內存在二次肥大區,預示著二次骨化中心(圖 4a)。 NamptΔPrx1 小鼠中不存在這種肥大。 相反,在整個骨骺上看到了許多空的軟骨細胞陷窩。 TUNEL染色顯示軟骨細胞大量死亡(圖4b)。 此外,NamptΔPrx1 小鼠的關節軟骨和半月板出現細胞減少(圖 4c)。 此外,NamptΔPrx1小鼠軟骨中軟骨細胞特異性基因(例如Acan、Col2a1和Col10a1以及Mmp13和Runx2)的mRNA水平大大降低(圖4d)。 相反,Vegfa 的表達不受影響。
圖四
間充質細胞中的NAD補償途徑對於次生骨化中心的形成和出生後的關節發育是不可或缺的。
在妊娠期母鼠的飲用水中添加 NR(pNR),並在 P7 時檢查後代。
a 對 Namptf/+(對照)和 Namptf/f;Prx1-Cre (NamptΔPrx1) 股骨 (n = 3) 的組織學切片進行 H&E 染色。 黑框被放大並顯示在右側。
b 股骨生長板中 TUNEL 測定的細胞死亡。
c 圖 a 中的組織學切片顯示了 NamptΔPrx1 小鼠膝關節處受損的淺表軟骨。
d 通過定量 RT-PCR 從後肢解剖的軟骨中指示基因的表達(n = 4 對照和 5 隻小鼠/組)。 線條代表平均值±SD,p 值由兩側學生 t 檢驗得出。 源數據作為源數據文件提供。
間充質細胞中的NAD補償途徑對於次生骨化中心的形成和出生後的關節發育是不可或缺的。
在妊娠期母鼠的飲用水中添加 NR(pNR),並在 P7 時檢查後代。
a 對 Namptf/+(對照)和 Namptf/f;Prx1-Cre (NamptΔPrx1) 股骨 (n = 3) 的組織學切片進行 H&E 染色。 黑框被放大並顯示在右側。
b 股骨生長板中 TUNEL 測定的細胞死亡。
c 圖 a 中的組織學切片顯示了 NamptΔPrx1 小鼠膝關節處受損的淺表軟骨。
d 通過定量 RT-PCR 從後肢解剖的軟骨中指示基因的表達(n = 4 對照和 5 隻小鼠/組)。 線條代表平均值±SD,p 值由兩側學生 t 檢驗得出。 源數據作為源數據文件提供。
在 P28 時,對照小鼠表現出完全發育和礦化的次級骨化中心,如 µCT 掃描所示(圖 5a)。 儘管在妊娠期間施用了 NR,Nampt 的缺失完全阻止了出生後骨骺的發育以及股骨和四肢所有其他骨骼的骨骼生長。 脛骨以及近端和遠端脛骨關節的組織學顯示,28 日齡的 NamptΔPrx1 小鼠的骨骺仍然是軟骨性的(圖 5b)。 然而,在妊娠期間,來自初級骨化中心的脛骨骨幹內形成了具有骨髓成分的透明骨領。 由於 Prx1-Cre 靶向成骨細胞譜系的所有細胞,因此我們還檢查了 28 日齡小鼠長骨內皮質表面的成骨細胞和骨形成。 在這個快速生長的年齡,成骨細胞幾乎覆蓋了對照小鼠的所有皮質內表面(圖5c)。 正如預期的那樣,這些表面上有大量的雙標籤(圖 5d)。 令人驚訝的是,NamptΔPrx1 小鼠的皮質內表面也覆蓋有活性成骨細胞和雙標記,其方式與對照組難以區分。 成骨細胞數量和骨形成率的量化顯示兩種基因型之間沒有差異(圖5c,d)。 然而,骨骼大小和形狀的主要差異使得很難準確確定成骨細胞中 Nampt 缺失可能產生的後果。
圖五
間充質細胞中的 NAD 補償途徑是出生後軟骨內骨形成所必需的,但不是膜內骨形成所必需的。
a P28時Namptf/+(對照)和Namptf/f;Prx1-Cre(NamptΔPrx1)小鼠股骨的MicroCT圖像。
b 對 NamptΔPrx1 小鼠的膝關節、脛骨和踝關節的組織學切片進行 H&E 染色,以說明缺乏礦化的次級骨化中心(n = 3隻小鼠/組)。
c 脛骨未脫礦組織切片的 H&E 染色代表性圖片(左)和皮質內表面成骨細胞數量的定量(右)(n = 3 隻小鼠/組)。 黑色箭頭表示覆蓋內皮質表面的成骨細胞。 BM=骨髓。
d 由白色箭頭(左)指示的內皮質表面雙鈣黃綠素標記的代表性圖片和礦物質沉積率(MAR)的量化(右)。 白色虛線標記骨表面。
e 雄性小鼠的代表性圖片。 f 全身重,以及(g)1 個月齡雄性小鼠(n = 5 只 NamptΔOsx1 和 12 只 Osx1-cre 小鼠/組)和雌性小鼠(n = 8 只 NamptΔOsx1 和 11 只 Osx1-cre 小鼠/組)的 DXA BMD。 線條代表平均值±SD,p 值由兩側學生 t 檢驗得出。 源數據作為源數據文件提供。
間充質細胞中的 NAD 補償途徑是出生後軟骨內骨形成所必需的,但不是膜內骨形成所必需的。
a P28時Namptf/+(對照)和Namptf/f;Prx1-Cre(NamptΔPrx1)小鼠股骨的MicroCT圖像。
b 對 NamptΔPrx1 小鼠的膝關節、脛骨和踝關節的組織學切片進行 H&E 染色,以說明缺乏礦化的次級骨化中心(n = 3隻小鼠/組)。
c 脛骨未脫礦組織切片的 H&E 染色代表性圖片(左)和皮質內表面成骨細胞數量的定量(右)(n = 3 隻小鼠/組)。 黑色箭頭表示覆蓋內皮質表面的成骨細胞。 BM=骨髓。
d 由白色箭頭(左)指示的內皮質表面雙鈣黃綠素標記的代表性圖片和礦物質沉積率(MAR)的量化(右)。 白色虛線標記骨表面。
e 雄性小鼠的代表性圖片。 f 全身重,以及(g)1 個月齡雄性小鼠(n = 5 只 NamptΔOsx1 和 12 只 Osx1-cre 小鼠/組)和雌性小鼠(n = 8 只 NamptΔOsx1 和 11 只 Osx1-cre 小鼠/組)的 DXA BMD。 線條代表平均值±SD,p 值由兩側學生 t 檢驗得出。 源數據作為源數據文件提供。
為了確定成骨細胞在骨骼發育過程中是否依賴於 Nampt,我們生成了 NamptΔOsx1 小鼠。 Osx1-Cre 靶向所有成骨細胞前體、成骨細胞和骨細胞以及少量增殖和肥大軟骨細胞23。 NamptΔOsx1小鼠在出生時和4週齡內與Osx1-Cre對照同窩小鼠幾乎沒有區別(圖5e),與NamptΔPrx1小鼠的結果形成鮮明對比(圖1)。 對體重(圖 5f)以及 4 週時總和股骨雙 X 射線吸收測定法(DXA)骨礦物質密度(BMD)(圖 5g)的評估顯示兩種基因型小鼠之間沒有差異。
軟骨細胞表現出需要 NADP+/NADPH 和 NAD+/NADH 氧化還原反應的代謝基因的高表達
軟骨細胞和成骨細胞對 NAD 補償途徑的不同依賴的一個可能解釋是,軟骨細胞存在於無血管的微環境中,導致它們缺氧並依賴營養擴散。 為了探討與其他細胞類型相比,循環營養物質的獲取減少可能是對 NAD 挽救途徑依賴的基礎,我們使用來自 2 篇出版物的公開單細胞 RNA 測序數據集檢查了代謝基因表達模式,其中作者使用了間充質細胞 - 來自年輕成年小鼠股骨的富集樣本24,25(圖6a)。 對該數據集中的非造血細胞進行綜合分析,發現了 10 種細胞類型,包括生長板軟骨細胞、關節軟骨細胞和成骨細胞,其特徵分別為 Col2a1、Prg4 和 Bglap 等特定基因的高表達(補充圖 6)。 根據軟骨細胞和其他細胞類型之間代謝相關基因轉錄的差異,我們使用報告代謝物分析確定了代謝熱點26。 該分析表明,與成骨細胞或骨中存在的其他間充質細胞群相比,生長板軟骨細胞代謝在涉及依賴於NAD+/NADH和NADP+/NADPH的氧化還原反應的過程中特別豐富(圖6b)。 高度依賴 NAD+/NADH 和 NADP+/NADPH 氧化還原反應的代謝過程之一是糖胺聚醣 (GAG) 的合成——軟骨細胞最豐富的基質成分27。 正如預期的那樣,軟骨細胞在硫酸軟骨素的代謝熱點處富集,硫酸軟骨素是軟骨細胞基質的主要成分。 NADPH 也是合成代謝過程(例如脂質和膽固醇合成)所必需的。 長鏈多不飽和脂肪酸 (PUFA) 的酰基輔酶 A (CoA) 衍生物的眾多熱點表明,生長板軟骨細胞中的脂肪生成上調。 這種化學修飾是非反應性脂肪酸參與生物合成或分解代謝途徑所必需的。 事實上,通過一系列去飽和和延伸反應,PUFA-CoA 可以轉化為生物活性產物28,29。 軟骨細胞中負責脂質合成和加工的多個基因上調,包括脂肪酸合成酶(Fasn)(圖6c),它利用NADPH將乙酰輔酶A轉化為棕櫚酸,並且是哺乳動物中唯一能夠將代謝糖轉化為脂肪酸的酶。 脂肪酸。 分別由 Fads1 和 Fads2 編碼的 delta-5 和 delta-6 去飽和酶(D5D 和 D6D)在軟骨細胞中也上調。 這些酶負責高度不飽和脂肪酸的合成並從 NADH30 再生 NAD+。 此外,D5D/D6D 提供了一種糖酵解 NAD+ 回收機制,當胞質 NAD+/NADH 比率降低時,允許持續糖酵解和細胞活力,類似於乳酸生成31。 內質網中的膽固醇合成利用 NADH 和 NADPH 作為多個步驟的電子源32。 軟骨細胞中負責膽固醇攝取和合成的多種酶也上調(圖6c)。
軟骨細胞表現出需要 NADP+/NADPH 和 NAD+/NADH 氧化還原反應的代謝基因的高表達
軟骨細胞和成骨細胞對 NAD 補償途徑的不同依賴的一個可能解釋是,軟骨細胞存在於無血管的微環境中,導致它們缺氧並依賴營養擴散。 為了探討與其他細胞類型相比,循環營養物質的獲取減少可能是對 NAD 挽救途徑依賴的基礎,我們使用來自 2 篇出版物的公開單細胞 RNA 測序數據集檢查了代謝基因表達模式,其中作者使用了間充質細胞 - 來自年輕成年小鼠股骨的富集樣本24,25(圖6a)。 對該數據集中的非造血細胞進行綜合分析,發現了 10 種細胞類型,包括生長板軟骨細胞、關節軟骨細胞和成骨細胞,其特徵分別為 Col2a1、Prg4 和 Bglap 等特定基因的高表達(補充圖 6)。 根據軟骨細胞和其他細胞類型之間代謝相關基因轉錄的差異,我們使用報告代謝物分析確定了代謝熱點26。 該分析表明,與成骨細胞或骨中存在的其他間充質細胞群相比,生長板軟骨細胞代謝在涉及依賴於NAD+/NADH和NADP+/NADPH的氧化還原反應的過程中特別豐富(圖6b)。 高度依賴 NAD+/NADH 和 NADP+/NADPH 氧化還原反應的代謝過程之一是糖胺聚醣 (GAG) 的合成——軟骨細胞最豐富的基質成分27。 正如預期的那樣,軟骨細胞在硫酸軟骨素的代謝熱點處富集,硫酸軟骨素是軟骨細胞基質的主要成分。 NADPH 也是合成代謝過程(例如脂質和膽固醇合成)所必需的。 長鏈多不飽和脂肪酸 (PUFA) 的酰基輔酶 A (CoA) 衍生物的眾多熱點表明,生長板軟骨細胞中的脂肪生成上調。 這種化學修飾是非反應性脂肪酸參與生物合成或分解代謝途徑所必需的。 事實上,通過一系列去飽和和延伸反應,PUFA-CoA 可以轉化為生物活性產物28,29。 軟骨細胞中負責脂質合成和加工的多個基因上調,包括脂肪酸合成酶(Fasn)(圖6c),它利用NADPH將乙酰輔酶A轉化為棕櫚酸,並且是哺乳動物中唯一能夠將代謝糖轉化為脂肪酸的酶。 脂肪酸。 分別由 Fads1 和 Fads2 編碼的 delta-5 和 delta-6 去飽和酶(D5D 和 D6D)在軟骨細胞中也上調。 這些酶負責高度不飽和脂肪酸的合成並從 NADH30 再生 NAD+。 此外,D5D/D6D 提供了一種糖酵解 NAD+ 回收機制,當胞質 NAD+/NADH 比率降低時,允許持續糖酵解和細胞活力,類似於乳酸生成31。 內質網中的膽固醇合成利用 NADH 和 NADPH 作為多個步驟的電子源32。 軟骨細胞中負責膽固醇攝取和合成的多種酶也上調(圖6c)。
圖六
軟骨細胞具有增強的氧化還原代謝。
基於兩個已發表的單細胞 RNA 測序數據集的單細胞 RNA-seq 分析,基於 UMAP 的非造血細胞主要類別(骨和骨髓部分)的可視化,並進行了事後註釋(有關細胞特異性,請參閱補充圖 2) 單個細胞類型的標記)並通過聚類著色。
b 使用報告代謝物分析測試繪製的單個細胞類型的選定報告代謝物的點圖26。
c 每個簇(列)細胞中代謝相關基因(行)的表達(歸一化表達水平的行範圍 Z 得分;單細胞 RNA 測序)。 帶星號的粗體表示需要 NAD/NADH 或 NADP/NADPH 氧化還原反應的酶。
軟骨細胞具有增強的氧化還原代謝。
基於兩個已發表的單細胞 RNA 測序數據集的單細胞 RNA-seq 分析,基於 UMAP 的非造血細胞主要類別(骨和骨髓部分)的可視化,並進行了事後註釋(有關細胞特異性,請參閱補充圖 2) 單個細胞類型的標記)並通過聚類著色。
b 使用報告代謝物分析測試繪製的單個細胞類型的選定報告代謝物的點圖26。
c 每個簇(列)細胞中代謝相關基因(行)的表達(歸一化表達水平的行範圍 Z 得分;單細胞 RNA 測序)。 帶星號的粗體表示需要 NAD/NADH 或 NADP/NADPH 氧化還原反應的酶。
如之前所示,軟骨細胞表現出參與糖酵解的基因上調(圖6c),糖酵解是這些細胞中的主要能量途徑。 在糖酵解過程中,利用 NAD+ 作為電子受體形成 NADH 的酶從葡萄糖中捕獲高能氫負離子。 在缺氧情況下,乳酸脫氫酶 (Ldha) 將丙酮酸轉化為乳酸,同時將 NADH 轉化為 NAD+,從而恢復細胞質中的 NAD+ 水平。 總體而言,本分析中強調的軟骨細胞和其他骨細胞之間的代謝差異與之前描述的對缺氧的代謝適應一致。 事實上,除了代謝和 ATP 產生的變化之外,細胞還通過改變脂質等大分子的生物合成來適應缺氧。
缺氧不會使軟骨細胞對 Nampt 抑制更敏感
軟骨細胞對缺氧的代謝適應,即糖酵解、脂質和膽固醇合成的上調30可能使它們更容易受到 Nampt 丟失的影響。 為了檢驗這種可能性,我們在常氧 (20% O2) 或缺氧 (1% O2) 下培養的原代軟骨細胞中使用了藥理學 Nampt 抑製劑 FK866 (1μM)。 軟骨細胞未經處理 2 天以適應缺氧,並用 FK866 再處理 1 或 2 天。 在缺氧總共 3 天和 4 天后,載體處理的細胞的 NAD 水平低於常氧條件下的細胞(圖 7a、b),這很可能反映了線粒體呼吸的減少。 如之前所示35,缺氧的細胞具有較高水平的 NADH/NAD 比率(圖 7c)。 在常氧或缺氧條件下,FK866 處理的細胞中 NAD+ 的水平實際上檢測不到(圖 7a、b)。 我們還研究了 FK866 處理後 NAD+ 消耗對 ATP 產生的影響。 媒介物處理的軟骨細胞在缺氧條件下培養3天后ATP水平降低(圖7d)。 然而,缺氧4天后,缺氧細胞中的ATP水平與常氧條件下培養的細胞中觀察到的ATP水平相似(圖7e)。 ATP 的這些變化很可能反映了細胞對缺氧的代謝適應,即線粒體依賴性能量產生減少和糖酵解依賴性能量產生增加。 Nampt 抑制也會導致 ATP 耗竭,但這種效應僅在 FK866 處理 2 天后才可見,並且在常氧和缺氧條件下的細胞之間相似(圖 7d、e)。 對分泌到培養基中的乳酸的測量證實,缺氧中的細胞利用糖酵解來產生能量(圖7f,g),並且FK866在治療2天后降低了乳酸水平,但在治療1天后沒有降低乳酸水平。 常氧和缺氧條件下 NAD+ 和 ATP 消耗之間的相似性並不支持僅缺氧導致生長板軟骨細胞對 Nampt 抑制高度敏感的觀點。 最有可能的是,低營養供應是軟骨細胞依賴 NAD 補償途徑的主要原因。
缺氧不會使軟骨細胞對 Nampt 抑制更敏感
軟骨細胞對缺氧的代謝適應,即糖酵解、脂質和膽固醇合成的上調30可能使它們更容易受到 Nampt 丟失的影響。 為了檢驗這種可能性,我們在常氧 (20% O2) 或缺氧 (1% O2) 下培養的原代軟骨細胞中使用了藥理學 Nampt 抑製劑 FK866 (1μM)。 軟骨細胞未經處理 2 天以適應缺氧,並用 FK866 再處理 1 或 2 天。 在缺氧總共 3 天和 4 天后,載體處理的細胞的 NAD 水平低於常氧條件下的細胞(圖 7a、b),這很可能反映了線粒體呼吸的減少。 如之前所示35,缺氧的細胞具有較高水平的 NADH/NAD 比率(圖 7c)。 在常氧或缺氧條件下,FK866 處理的細胞中 NAD+ 的水平實際上檢測不到(圖 7a、b)。 我們還研究了 FK866 處理後 NAD+ 消耗對 ATP 產生的影響。 媒介物處理的軟骨細胞在缺氧條件下培養3天后ATP水平降低(圖7d)。 然而,缺氧4天后,缺氧細胞中的ATP水平與常氧條件下培養的細胞中觀察到的ATP水平相似(圖7e)。 ATP 的這些變化很可能反映了細胞對缺氧的代謝適應,即線粒體依賴性能量產生減少和糖酵解依賴性能量產生增加。 Nampt 抑制也會導致 ATP 耗竭,但這種效應僅在 FK866 處理 2 天后才可見,並且在常氧和缺氧條件下的細胞之間相似(圖 7d、e)。 對分泌到培養基中的乳酸的測量證實,缺氧中的細胞利用糖酵解來產生能量(圖7f,g),並且FK866在治療2天后降低了乳酸水平,但在治療1天后沒有降低乳酸水平。 常氧和缺氧條件下 NAD+ 和 ATP 消耗之間的相似性並不支持僅缺氧導致生長板軟骨細胞對 Nampt 抑制高度敏感的觀點。 最有可能的是,低營養供應是軟骨細胞依賴 NAD 補償途徑的主要原因。
圖七
Nampt 抑制對常氧和缺氧培養的軟骨細胞中 ATP 產生具有相似的影響。
來自野生型 C57BL/6 小鼠的原代軟骨細胞在常氧 (20% O2) 或缺氧 (1% O2) 中培養總共 3 天,並在最後 24 小時用載體或 FK866 處理(a、d、f) ,或總共 4 天並在最後 48 小時內進行治療(b、c、e、g)。 測量細胞內 NAD+(n = 3 孔)(a、b)、NADH/NAD 比率(n = 3 孔)(c)、細胞內 ATP(n = 8 孔)(d、e)和培養基中的乳酸( n = 8 孔)(f,g)。 圖表描繪了代表性實驗。 每個點代表重複孔。 每個實驗重複兩次。 線條代表平均值±SD,p 值由學生 t 檢驗得出。 源數據作為源數據文件提供。
Nampt 抑制對常氧和缺氧培養的軟骨細胞中 ATP 產生具有相似的影響。
來自野生型 C57BL/6 小鼠的原代軟骨細胞在常氧 (20% O2) 或缺氧 (1% O2) 中培養總共 3 天,並在最後 24 小時用載體或 FK866 處理(a、d、f) ,或總共 4 天並在最後 48 小時內進行治療(b、c、e、g)。 測量細胞內 NAD+(n = 3 孔)(a、b)、NADH/NAD 比率(n = 3 孔)(c)、細胞內 ATP(n = 8 孔)(d、e)和培養基中的乳酸( n = 8 孔)(f,g)。 圖表描繪了代表性實驗。 每個點代表重複孔。 每個實驗重複兩次。 線條代表平均值±SD,p 值由學生 t 檢驗得出。 源數據作為源數據文件提供。
Nampt 的缺失顯著影響生長板軟骨細胞的轉錄組學特徵
接下來,我們對從妊娠期間餵食 NR 的母鼠出生的 P2 小鼠的生長板中分離的細胞進行了 scRNA 測序。 經過質量控制後,我們對 13,965 個高質量細胞(分別來自對照和 NamptΔPrx1 的 6788 個和 7177 個細胞)進行了分析,每個細胞平均有超過 47,000 個獨特的分子標識符 (UMI),每個細胞平均有約 3000 個基因。 對兩種基因型小鼠的細胞進行協調後,最初的 UMAP 圖和聚類分析根據簇特異性標記物的表達(補充圖 8)揭示了 11 個簇(補充圖 7)。 在分析的細胞中,6693 個細胞是軟骨細胞,4449 個間充質細胞(Fibro-1、Fibro-2 和 Fibro-3)、1303 個肌腱細胞和 1520 個壁細胞(週細胞 I、週細胞 II 和內皮細胞)。 由於每個週細胞和內皮細胞簇都包含少量細胞,因此我們排除了這些細胞並考慮了 8 個主要簇進行進一步分析(圖 8a)。 來自對照和 NamptΔPrx1 小鼠的軟骨細胞亞群包括軟骨細胞 I、軟骨細胞 II、關節軟骨細胞和增殖軟骨細胞。 這些簇均表達 Col2a1、Acan 和 Sox9 等標記物,而 Prg4 在關節軟骨細胞中表達(圖 8b)。 其他簇包括被命名為 fabric-1、fibre-2 的間充質前體細胞 [根據之前的研究24,25 鑑定],以及 film-3 和肌腱細胞(包括韌帶細胞)(圖 8a)。 具體而言,Fiber-1 表達常見的干細胞標誌物 Ly6a、Ecm1 和 Tspo; Fiber-2 表達 Lpl、Cebpd 和 Cxcl12; Fiber-3 表達 Tnn、Col8a1 和 Nrp2; 肌腱細胞表達 Tnmd、Thbs4 和 Kera(圖 8c)。 刪除Nampt會導致關節軟骨細胞以及表達Prg4的纖維2的數量急劇減少; 對於不表達Prg4的軟骨細胞,從簇I轉移到簇II(圖8d,e)。 有趣的是,對照小鼠與NamptΔPrx1小鼠中增殖軟骨細胞和其他間充質細胞的百分比相似(圖8e)。 Nampt 的刪除也增加了 fil-1 和肌腱細胞的相對數量。
接下來,我們對從妊娠期間餵食 NR 的母鼠出生的 P2 小鼠的生長板中分離的細胞進行了 scRNA 測序。 經過質量控制後,我們對 13,965 個高質量細胞(分別來自對照和 NamptΔPrx1 的 6788 個和 7177 個細胞)進行了分析,每個細胞平均有超過 47,000 個獨特的分子標識符 (UMI),每個細胞平均有約 3000 個基因。 對兩種基因型小鼠的細胞進行協調後,最初的 UMAP 圖和聚類分析根據簇特異性標記物的表達(補充圖 8)揭示了 11 個簇(補充圖 7)。 在分析的細胞中,6693 個細胞是軟骨細胞,4449 個間充質細胞(Fibro-1、Fibro-2 和 Fibro-3)、1303 個肌腱細胞和 1520 個壁細胞(週細胞 I、週細胞 II 和內皮細胞)。 由於每個週細胞和內皮細胞簇都包含少量細胞,因此我們排除了這些細胞並考慮了 8 個主要簇進行進一步分析(圖 8a)。 來自對照和 NamptΔPrx1 小鼠的軟骨細胞亞群包括軟骨細胞 I、軟骨細胞 II、關節軟骨細胞和增殖軟骨細胞。 這些簇均表達 Col2a1、Acan 和 Sox9 等標記物,而 Prg4 在關節軟骨細胞中表達(圖 8b)。 其他簇包括被命名為 fabric-1、fibre-2 的間充質前體細胞 [根據之前的研究24,25 鑑定],以及 film-3 和肌腱細胞(包括韌帶細胞)(圖 8a)。 具體而言,Fiber-1 表達常見的干細胞標誌物 Ly6a、Ecm1 和 Tspo; Fiber-2 表達 Lpl、Cebpd 和 Cxcl12; Fiber-3 表達 Tnn、Col8a1 和 Nrp2; 肌腱細胞表達 Tnmd、Thbs4 和 Kera(圖 8c)。 刪除Nampt會導致關節軟骨細胞以及表達Prg4的纖維2的數量急劇減少; 對於不表達Prg4的軟骨細胞,從簇I轉移到簇II(圖8d,e)。 有趣的是,對照小鼠與NamptΔPrx1小鼠中增殖軟骨細胞和其他間充質細胞的百分比相似(圖8e)。 Nampt 的刪除也增加了 fil-1 和肌腱細胞的相對數量。
圖八
Nampt 缺失極大地影響軟骨細胞中的基因表達。
NR 在妊娠期間對母鼠進行施用。 對從 P2 NamptΔPrx1 和妊娠期間接受 NR 的母鼠所生的同窩對照小鼠的生長板中提取的細胞進行單細胞 RNA-seq 分析。 從兩種基因型小鼠獲得的軟骨細胞和其他間充質譜系細胞的 UMAP 圖。
b UMAP 坐標上單個細胞的關鍵已知軟骨細胞標記的基因表達圖。
c 聚類 1-8 中頂級標記基因分佈的點圖。
d 從對照小鼠與NamptΔPrx1小鼠獲得的圖a中描述的不同細胞類型的UMAP圖; 產前 NR (pNR)。
e 條形圖描繪了 (d) 中所示的細胞簇內細胞的數量和百分比。
Nampt 缺失極大地影響軟骨細胞中的基因表達。
NR 在妊娠期間對母鼠進行施用。 對從 P2 NamptΔPrx1 和妊娠期間接受 NR 的母鼠所生的同窩對照小鼠的生長板中提取的細胞進行單細胞 RNA-seq 分析。 從兩種基因型小鼠獲得的軟骨細胞和其他間充質譜系細胞的 UMAP 圖。
b UMAP 坐標上單個細胞的關鍵已知軟骨細胞標記的基因表達圖。
c 聚類 1-8 中頂級標記基因分佈的點圖。
d 從對照小鼠與NamptΔPrx1小鼠獲得的圖a中描述的不同細胞類型的UMAP圖; 產前 NR (pNR)。
e 條形圖描繪了 (d) 中所示的細胞簇內細胞的數量和百分比。
Nampt 的缺失會抑制軟骨細胞中的多種代謝途徑
由於 Nampt 缺失的一個主要後果是軟骨細胞 I 和 II 之間的細胞數量發生變化,因此我們將分析重點放在這兩個簇之間的比較上。 當比較軟骨細胞 II 和軟骨細胞 I 時,差異基因表達分析(調整後的 p<<10e-10 和 log2 平均倍數變化 <0.5)鑑定出 50 個上調基因和 3642 個下調基因(圖 9a 和補充數據 1)。 這強烈表明來自 NamptΔPrx1 小鼠的軟骨細胞的異常轉錄程序。 具體而言,軟骨細胞II中許多編碼膠原蛋白(Col9a3、Col11a1、Col9a1、Col9a2)和其他細胞外基質(ECM)蛋白(Epyc、Dcn、Snorc、Ucma)的基因的表達受到抑制(圖9a)。 相比之下,參與應激反應的基因,如Hmga2、Spry2、Ptgs2 (Cox2)和Neat1,以及先前與骨關節炎軟骨細胞相關的基因,如Postn、Tnfai6、Tmsb4x,在軟骨細胞II中表達上調(圖9a和9a)。 補充圖9)。 RNA原位雜交證實了NamptΔPrx1後肢生長板中Ptgs2和Pim3的表達升高(圖9b和補充圖10)。 有趣的是,Ptgs2 的表達局限於骨表面和鄰近滑膜、軟骨膜和半月板的細胞。 在對照小鼠中,Ptgs2 主要局限於增殖和肥大區(補充圖 10)。 表達Ptgs2的細胞的定位讓人想起相同實驗設計的NamptΔPrx1小鼠中TUNEL陽性細胞的定位(圖3)。 Pim3 在與表達 Ptgs2 的軟骨細胞亞群不同的軟骨細胞 II 亞群中上調(補充圖 9),在多個生長板區域中升高(圖 9b 和補充圖 10)。
由於 Nampt 缺失的一個主要後果是軟骨細胞 I 和 II 之間的細胞數量發生變化,因此我們將分析重點放在這兩個簇之間的比較上。 當比較軟骨細胞 II 和軟骨細胞 I 時,差異基因表達分析(調整後的 p<<10e-10 和 log2 平均倍數變化 <0.5)鑑定出 50 個上調基因和 3642 個下調基因(圖 9a 和補充數據 1)。 這強烈表明來自 NamptΔPrx1 小鼠的軟骨細胞的異常轉錄程序。 具體而言,軟骨細胞II中許多編碼膠原蛋白(Col9a3、Col11a1、Col9a1、Col9a2)和其他細胞外基質(ECM)蛋白(Epyc、Dcn、Snorc、Ucma)的基因的表達受到抑制(圖9a)。 相比之下,參與應激反應的基因,如Hmga2、Spry2、Ptgs2 (Cox2)和Neat1,以及先前與骨關節炎軟骨細胞相關的基因,如Postn、Tnfai6、Tmsb4x,在軟骨細胞II中表達上調(圖9a和9a)。 補充圖9)。 RNA原位雜交證實了NamptΔPrx1後肢生長板中Ptgs2和Pim3的表達升高(圖9b和補充圖10)。 有趣的是,Ptgs2 的表達局限於骨表面和鄰近滑膜、軟骨膜和半月板的細胞。 在對照小鼠中,Ptgs2 主要局限於增殖和肥大區(補充圖 10)。 表達Ptgs2的細胞的定位讓人想起相同實驗設計的NamptΔPrx1小鼠中TUNEL陽性細胞的定位(圖3)。 Pim3 在與表達 Ptgs2 的軟骨細胞亞群不同的軟骨細胞 II 亞群中上調(補充圖 9),在多個生長板區域中升高(圖 9b 和補充圖 10)。
圖九
Nampt 缺失嚴重影響細胞代謝。
軟骨細胞 II 和軟骨細胞 I 之間差異基因表達結果的火山圖,如圖 8 所示,使用帶有錯誤發現率調整 p 值的雙邊 MAST 統計檢驗69。 一些關鍵基因被標記在圖上。 軟骨細胞 II 中下調的基因為綠色,上調的基因為紫色。
b P2 Namptf/+(對照)和 Namptf/f;Prx1-Cre (NamptΔPrx1) 膝蓋(代表每個基因型 2-3 隻幼崽)的連續切片,顯示蛋白聚醣的番紅 O 染色(左),Ptgs2 的原位雜交(中) ) 和 Pim3(右); 產前 NR (pNR)。
c,d 基於軟骨細胞 II 和軟骨細胞 I 之間差異基因表達的功能富集分析關鍵結果的點圖。根據基因本體論 (GO),軟骨細胞 II 中富集的過程為紫色,而被抑制的過程為綠色 (c), 和報告代謝物 (d)。
Nampt 缺失嚴重影響細胞代謝。
軟骨細胞 II 和軟骨細胞 I 之間差異基因表達結果的火山圖,如圖 8 所示,使用帶有錯誤發現率調整 p 值的雙邊 MAST 統計檢驗69。 一些關鍵基因被標記在圖上。 軟骨細胞 II 中下調的基因為綠色,上調的基因為紫色。
b P2 Namptf/+(對照)和 Namptf/f;Prx1-Cre (NamptΔPrx1) 膝蓋(代表每個基因型 2-3 隻幼崽)的連續切片,顯示蛋白聚醣的番紅 O 染色(左),Ptgs2 的原位雜交(中) ) 和 Pim3(右); 產前 NR (pNR)。
c,d 基於軟骨細胞 II 和軟骨細胞 I 之間差異基因表達的功能富集分析關鍵結果的點圖。根據基因本體論 (GO),軟骨細胞 II 中富集的過程為紫色,而被抑制的過程為綠色 (c), 和報告代謝物 (d)。
差異表達基因的基因本體(GO)富集分析表明,與線粒體活性、翻譯、蛋白質分泌和碳水化合物代謝過程相關的細胞成分和生物過程在軟骨細胞II中下調。 另一方面,軟骨細胞II中血管生成、細胞粘附和細胞死亡等生物過程上調(圖9c)。 著眼於細胞代謝,記者代謝物分析顯示,軟骨細胞II中絲氨酸、脯氨酸、甘氨酸和天冬酰胺等氨基酸的代謝熱點減少了(圖9d)。 脯氨酸和甘氨酸構成膠原蛋白分子的主幹,因此軟骨細胞 II 中這些氨基酸代謝的減少與 ECM 主要膠原成分錶達的減少一致。 此外,涉及依賴於NAD+/NADH的氧化還原反應的過程在軟骨細胞II中減少,與Nampt缺陷小鼠中異常軟骨細胞群的增加一致(圖9d)。 軟骨細胞II中涉及碳水化合物代謝的關鍵酶的表達受到抑制,例如Ldha、Phgdh和Ugdh,它們分別介導無氧糖酵解、絲氨酸合成和GAG生物合成(圖9a和補充數據1)。 報告代謝物分析還顯示,軟骨細胞 II 中泛醌/泛醇代謝減少(圖 9d)。 泛醌是線粒體能量產生所必需的,是 ROS 的重要來源,並且其還原形式(泛醇)具有抗氧化特性36。
缺乏Nampt的軟骨細胞表現出代謝缺陷
為了檢查 scRNA-seq 分析的一些關鍵發現的功能相關性,我們培養了來自對照小鼠和 NamptΔPrx1 小鼠生長板的細胞。 正如預期的那樣,缺乏 Nampt 的細胞 NAD+ 水平降低(補充圖 11a)。 接下來我們檢查了糖酵解速率,因為這是軟骨細胞的主要能量來源。 正如使用 SeaHorse 測量的細胞外酸化率 (ECAR) 所示,NamptΔPrx1 小鼠的細胞表現出糖酵解減少(補充圖 11b)。 因此,缺乏 Nampt 的細胞中 ATP 水平較低(補充圖 11c)。 我們還發現這些細胞中 ROS 水平增加(補充圖 11d),這可能是由於泛醌/泛醇和其他代謝過程的改變所致。 由於 NAD+ 是 Sirtuins 和 PARP 等蛋白質的關鍵輔助因子,因此我們通過蛋白質印跡檢查了賴氨酸乙酰化水平和 PAR 水平,分別是 Sirtuins 和 PARP 活性的指標。 在 NamptΔPrx1 小鼠的細胞中觀察到 PAR 適度降低和賴氨酸乙酰化增加(補充圖 11e)。 我們還檢測了多種 Sirtuins 或 Parps 的表達在軟骨細胞 II 中與軟骨細胞 I 中是否發生改變。在 7 個 Sirtuin 家族成員中,軟骨細胞 II 中 Sirt1 和 Sirt2 的表達略有下降(補充數據 1)。 在培養的 NamptΔPrx1 小鼠軟骨細胞中,Sirt1 的蛋白質水平略有下降(補充圖 11e)。 在 17 個 Parp 家族成員中,軟骨細胞 II 中 Parp2 和 Parp8 的表達降低(補充數據 1)。 Parp 家族的一些成員,包括 Parp2,與 DNA 損傷修復有關37。 過多的 ROS 和 Parp 活性降低會導致 DNA 損傷的積累。 因此,我們檢查了 γ-H2AX(DNA 損傷指標)的蛋白質水平,但發現對照小鼠和 NamptΔPrx1 小鼠的細胞之間沒有差異(補充圖 11e)。 儘管如此,由於培養條件不能複制生長板中細胞所經歷的有限營養供應,因此在培養細胞中觀察到的變化相對於體內條件很可能減弱。 結合 scRNA-seq 分析,這些發現表明 Nampt 缺失導致軟骨細胞中的許多代謝紊亂,從而導致細胞應激和快速細胞死亡。
缺乏Nampt的軟骨細胞表現出代謝缺陷
為了檢查 scRNA-seq 分析的一些關鍵發現的功能相關性,我們培養了來自對照小鼠和 NamptΔPrx1 小鼠生長板的細胞。 正如預期的那樣,缺乏 Nampt 的細胞 NAD+ 水平降低(補充圖 11a)。 接下來我們檢查了糖酵解速率,因為這是軟骨細胞的主要能量來源。 正如使用 SeaHorse 測量的細胞外酸化率 (ECAR) 所示,NamptΔPrx1 小鼠的細胞表現出糖酵解減少(補充圖 11b)。 因此,缺乏 Nampt 的細胞中 ATP 水平較低(補充圖 11c)。 我們還發現這些細胞中 ROS 水平增加(補充圖 11d),這可能是由於泛醌/泛醇和其他代謝過程的改變所致。 由於 NAD+ 是 Sirtuins 和 PARP 等蛋白質的關鍵輔助因子,因此我們通過蛋白質印跡檢查了賴氨酸乙酰化水平和 PAR 水平,分別是 Sirtuins 和 PARP 活性的指標。 在 NamptΔPrx1 小鼠的細胞中觀察到 PAR 適度降低和賴氨酸乙酰化增加(補充圖 11e)。 我們還檢測了多種 Sirtuins 或 Parps 的表達在軟骨細胞 II 中與軟骨細胞 I 中是否發生改變。在 7 個 Sirtuin 家族成員中,軟骨細胞 II 中 Sirt1 和 Sirt2 的表達略有下降(補充數據 1)。 在培養的 NamptΔPrx1 小鼠軟骨細胞中,Sirt1 的蛋白質水平略有下降(補充圖 11e)。 在 17 個 Parp 家族成員中,軟骨細胞 II 中 Parp2 和 Parp8 的表達降低(補充數據 1)。 Parp 家族的一些成員,包括 Parp2,與 DNA 損傷修復有關37。 過多的 ROS 和 Parp 活性降低會導致 DNA 損傷的積累。 因此,我們檢查了 γ-H2AX(DNA 損傷指標)的蛋白質水平,但發現對照小鼠和 NamptΔPrx1 小鼠的細胞之間沒有差異(補充圖 11e)。 儘管如此,由於培養條件不能複制生長板中細胞所經歷的有限營養供應,因此在培養細胞中觀察到的變化相對於體內條件很可能減弱。 結合 scRNA-seq 分析,這些發現表明 Nampt 缺失導致軟骨細胞中的許多代謝紊亂,從而導致細胞應激和快速細胞死亡。
Source:
Nat Commun. 2023; 14: 3616.
Published online 2023 Jun 17.
doi: 10.1038/s41467-023-39392-7
PMCID: PMC10276814
PMID: 37330524
The NAD salvage pathway in mesenchymal cells is indispensable for skeletal development in mice
Aaron Warren, Ryan M. Porter, Olivia Reyes-Castro, Md Mohsin Ali, Adriana Marques-Carvalho, Ha-Neui Kim, Landon B. Gatrell, Ernestina Schipani, Intawat Nookaew, Charles A. O’Brien, Roy Morello, and Maria Almeida
Nat Commun. 2023; 14: 3616.
Published online 2023 Jun 17.
doi: 10.1038/s41467-023-39392-7
PMCID: PMC10276814
PMID: 37330524
The NAD salvage pathway in mesenchymal cells is indispensable for skeletal development in mice
Aaron Warren, Ryan M. Porter, Olivia Reyes-Castro, Md Mohsin Ali, Adriana Marques-Carvalho, Ha-Neui Kim, Landon B. Gatrell, Ernestina Schipani, Intawat Nookaew, Charles A. O’Brien, Roy Morello, and Maria Almeida